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水产品中孔雀石绿残留快速检测技术的现状与突破

作者:zhong   来源:食安科技   发表时间:2019-09-16   点击:143

   水产品在我国动物产品消费中始终占据重要地位,且消费份额较大——全国人均水产品消费约占猪牛羊肉消费量的一半。随着国民生活水平的提升,人们对水产品的需求量也在逐年增加,这促使水产养殖业快速发展,但同时也引发了不少食品质量安全问题。目前,国内市场主要以鲜活水产品为主,养殖户为有效预防鱼类等患病和增加产量,通常会非法使用禁用药物,加之操作不规范,往往导致水产品质量不合格,如消费者食用了药物超标的水产品,严重的会危及生命。水产质量安全问题日益突出,引起了政府和消费者的广泛关注,建立有效解决水产中禁用药物的快速检测机制已迫在眉睫。水产品的质量安全是全国人民享有健康生活的重要保障,而水产品中违禁药物残留是当前危害最严重的因素之一,孔雀石绿就是其中具有代表性的一种违禁药物。

 
  2014年9月,深圳特区布吉海鲜市场开展了一次名为“清水行动”的水产品专项执法监督抽查。此次行动中,执法部门共抽检了43家水产品经营户,共抽取样品121份,其中淡水鱼样品90份。经检测,发现7个水产品样品不合格(孔雀石绿超标5个,硝基呋喃代谢物超标2个);2016年底,被国内媒体“热搜”的北京超市“活鱼下架事件”引起大众关注,社会普遍认为其与孔雀石绿的滥用有关;2019年4月,山东省农业农村厅委托山东省水产品质量检验中心对临朐县水产品进行质量安全抽检,被抽检的6个鲟鱼样品检验呈阳性,结果为孔雀石绿含量超标;同年6月,杭州市消保委对市属7家买菜类APP进行消费评测,结果为杭州美团、叮咚买菜的鳜鱼,天津永辉超市的草鱼均被检出孔雀石绿超标。由此可见,孔雀石绿残留问题已成为一项日益突出的食品安全问题。
 
1 什么是孔雀石绿?
 
  孔雀石绿作为染色剂常被用于皮革业、纺织业、制陶业、食品和生物等领域,是人工合成的三苯甲烷类化学物。同时,孔雀石绿也可以作为杀菌剂、驱虫剂,用于预防与治疗水生动物的细菌、真菌和寄生虫感染,由于其成本低廉且效果显著,因此被普遍用于水产养殖业。然而随着研究的深入,孔雀石绿高毒性、高残留的性质及潜在的致畸、致癌、致突变等毒副作用备受研究人员和消费者关注。鉴于孔雀石绿潜在的致癌性,美国、加拿大、日本、欧盟等国家将其列为水产养殖禁用药物。欧盟法案2002/675/EC规定,动物源性食品中MG(孔雀石绿)和LMG(无色孔雀石绿)残留限量为2μg/kg;日本肯定列表明确规定,在进口水产品中不得检出MG残留。我国于2002年5月将孔雀石绿列入《食品动物禁用的兽药及其他化合物清单》,并于2005年制定了孔雀石绿的使用标准,规定水产品中的MG和LMG的残留总限量不得超过1μg/kg。尽管如此,违规使用孔雀石绿的事件仍然时有发生——欧盟、日本、中国香港等国家和地区均曾从由我国大陆进口的鳗鱼中检测出MG和LMG残留,这不仅影响生态环境,还会成为制约我国大陆地区食品质量安全和国际市场竞争力的重要因素。
 
2 检测技术的应用
 
  孔雀石绿进入动物体内后会快速代谢为无色孔雀石绿,而无色孔雀石绿为脂溶性物质,相较孔雀石绿而言毒性更强,且基本无法代谢。国内外均以孔雀石绿及其代谢物无色孔雀石绿的总量为测定指标,目前测定方法主要有仪器分析测定法(高效液相法、液相色谱质谱联用法等)、免疫学检测技术(酶联免疫检测技术、胶体金检测技术等),以及微光探测与免疫学技术的结合方法(荧光定量检测技术)等。对于快速筛查市场而言,后两种方法已逐渐成为检测应用的主流手段。
 
2.1 仪器分析法
 
  仪器分析法主要是指利用气相色谱法、气相色谱-串联质谱法、液相色谱法、高效液相色谱-串联质谱法或各类光谱仪等大型精密仪器来进行药物残留的分析方法。这是一种准确性高、灵敏度高、特异性好、选择性强的检测方法,现普遍用于检测兽药和农药残留,许多国家和地区已将高效液相色谱-串联质谱法作为检测水产品中孔雀石绿残留的确证方法。但是,此方法不仅需要使用昂贵的检测仪器,还需专业技术人员进行操作,无法实现大批量快速检测。同时,该方法成本相对较高,且不具备现场快速筛查的相关条件。
 
2.2 免疫学检测技术
 
  免疫学检测技术利用抗原与抗体的特异性结合原理,相较于仪器分析法而言,其最大的优势为操作便捷,有利于实现市场的快速筛查。现阶段,用于食品安全的免疫学检测技术主要有酶联免疫检测技术和胶体金检测技术。
 
2.2.1 酶联免疫检测技术
 
  该技术的原理是应用抗原和抗体的特异结合与酶催化作用的有机结合,利用酶促反应原理放大了免疫检测的效果,在具有较高灵敏度的同时还具备了定量检测的特性。这一检测技术的优点是检测灵敏度高、特异性好、高通量和高精密度,且无需大型仪器设备就可进行大批量的样品初筛检测。该法虽然较仪器法具有一定优势,但由于其检测时需专业人员操作,且检测时间较长,亦无法满足现场快速筛查的需求。
 
2.2.2 胶体金检测技术
 
  胶体金检测技术是以纳米金颗粒作为示踪标识物,利用抗原和抗体具有特异性结合的原理所建立的新型免疫标记技术,是色谱层析技术和纳米金技术的有机结合。该技术的优点是操作简单、检测时间短且无需专业技术人员操作,因此胶体金技术被广泛应用于大分子类蛋白、农药残留、兽药残留、小分子类药物和毒素类等的快速检测中。虽然胶体金法具有一定的优势,但由于其灵敏度较差,有漏检风险,仍无法满足国家检测标准的要求。
 
2.3 微光探测与免疫学技术的结合
 
  随着各类学科的交叉发展,现代化快速检测技术越来越趋向于便携快速、操作简单、检测结果即时准确的方向发展,这也使开发出的相应产品具有极大的市场潜力,而荧光定量检测技术就是食品安全快速检测市场中最具代表性的新型检测方法之一。此方法是对免疫学技术、色谱层析技术、生物探针技术和微光探测技术的有机结合,且兼具仪器分析法、酶联免疫检测技术、胶体金检测技术的优点,取长补短,在保持仪器分析法高精确性的同时还保留了胶体金法检测的快速、简便和酶免技术的高灵敏度、可定量的特点。
 
图1 孔雀石绿快速检测试剂盒
 
3 孔雀石绿检测技术的发展
 
  孔雀石绿的残留主要体现在水产品中,且在高油酯鱼类中尤为明显,所以针对孔雀石绿的检测对象主要为可食用组织,根据该情况我国也建立了孔雀石绿在可食用性组织中的国家检测标准,但由于其需要昂贵的仪器和复杂的样本处理过程,故难以在现场快速筛查场景和基层执法部门中大量推广。在快速检测产品中,孔雀石绿酶免试剂盒最早进入快速筛查市场,但由于其繁琐的操作过程,很快被胶体金产品所取代。孔雀石绿胶体金产品虽然检测速度快(只需30~45分钟),但其灵敏度较差,增加了漏检风险。同时,组织类样本的前处理过程依然复杂费时(需要离心、吹干等步骤),不仅增加了人力成本,也会在吹干大量溶剂时污染环境。针对以上问题,食品检测市场一直在寻求解决方法,近年来推出的SPE产品就是对吹干步骤的优化处理。SPE方法虽然省略了吹干环节,使处理速度有了一定的提升,但同样存在着一些不足:首先,步骤和仪器未得到省略,仍需使用离心及相应的仪器,吹干步骤换成了过SPE柱,同时也增加了固相萃取仪;其次,SPE柱成本较高,约增加20%~40%的成本;第三,吸附和洗脱时均需大量试剂,这就在无形之中浪费了溶剂;第四,洗脱效率不稳定。
 
  针对当前快速检测方法存在的问题,广东达元绿洲食品安全科技股份有限公司(以下简称“食安科技”)经过长时间的技术攻关,结合高分子纳米材料和免疫层析卡的优点,开发了全新的孔雀石绿残留快速检测卡,并结合先进的专利数据采集技术,研制出了创新的孔雀石绿FST快速前处理方案(包含胶体金和荧光层析系列产品),较传统检测产品而言,其检测效率提高2倍以上,灵敏度更优,精密性更好,智能化更高。
 
4 FST快速前处理方案
 
  FST的技术理念基于组织类样本快速便捷的前处理方案,是食安科技专门为解决繁琐的组织类样本前处理问题而开发的国内外首创方案,可谓组织类样本POCT技术的一大突破。其省略了离心、吹干或上萃取柱步骤,实验全程只需一把移液器即可完成操作,大大缩短了样本检测时间,降低了检测难度。
 
  目前,食安科技的FST系列产品包括两大类——FST-胶体金类和FST-荧光层析类。孔雀石绿FST-胶体金产品在保持同类市场高灵敏度检测的前提下,把组织类的样本处理进行了极简化处理,处理时间从常规的25~40分钟缩短为10分钟以内,整个检测过程无需任何辅助仪器,节省了人力及物力成本,并顺利通过了2018年的农业部验证和2019年的广东省快检验证。
 
 
  虽然孔雀石绿FST-胶体金产品在性能上有了较大提升,但其不能定量的缺点始终无法解决。针对这一难点,食安科技开发了FST-荧光层析系列产品,其结合高分子纳米技术和微光探测技术,实为FST-胶体金产品性能的进一步提升,具有灵敏度高(可达液相质谱的灵敏度要求)、样本处理快速(缩短为5分钟以内)、抗干扰能力更强(较大稀释比例降低了样本对产品的干扰)、半定量的检测(检测结果以数据显示)、数据即时处理(数据即时存储或打印)等优势。孔雀石绿FST-荧光层析产品顺利通过了2018年农业部验证,成为全场检测时间最短、灵敏度最高的快速检测产品之一。为了更好的区分现有市场中主流检测产品间的差异,本文针对参加2018年农业部验证的相关技术产品做了简单的比较,如表1。
 
5 结论与展望
 
  水产品是国民餐桌食物的重要组成部分,我国政府也一直致力于解决食品安全问题,近年来更是针对水产品药物残留加大了抽检力度。孔雀石绿一直是人们关注的重点,但由于现有检测技术的样本前处理过程较为繁琐,抽检率无法大幅提升。因此,随着政府的管控进一步加强,快速筛查市场对现有的检测技术也必将提出更高要求。快速、便捷、准确、智能化等一直是快速检测的重要需求,而食安科技的FST前处理技术恰巧是对这一需求的良好补充。随着FST技术的进一步发展,相信其将对孔雀石绿滥用情况的监管工作产生积极影响。


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